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斑馬魚呼吸代謝及行為分析技術在生物醫學領域的應用
發布時間： 2022-05-17 點擊次數： 3474次斑馬魚作為一種模式動物，與人類共享高達 70% 的基因組，保留了多達 80% 的人類疾病相關蛋白。同樣作為一種脊椎動物，斑馬魚與人類的組織和發育生物學過程相似，故而針對各種癌癥、肝病、血液疾病、心臟病和行為障礙的斑馬魚模型被建立起來，斑馬魚進而成為了基因表達調控、發病機理、藥物篩選領域的主要模式動物，在生物醫學研究的地位越來越重要(Patton et al., 2021)。
北京易科泰提供生物醫學領域斑馬魚呼吸代謝及行為分析的全套技術方案，包括斑馬魚成魚和魚卵、胚胎、幼魚的呼吸代謝測量、斑馬魚視頻跟蹤和行為分析及游泳能力評估。具體測量參數及應用方向如下：
模塊
功能
關鍵參數
應用方向
成魚呼吸代謝測量
4通道/8通道、自動長期監測
耗氧率（MO2/VO2)、
標準代謝率SMR
人類疾病研究：肥胖、2型糖尿病等代謝性疾病、
運動神經元相關疾病、心肌病等；
微量元素營養等
魚卵、胚胎、幼魚高通量呼吸代謝測量
24+通道高通量測量
耗氧率（MO2/VO2)
高通量視頻跟蹤及行為分析
24+通道高通量分析
速度、活動/非活動時間和比例、運動軌跡、
不同類型游泳行為統計
游泳能力
自動化測量、分析
游泳訓練
臨界游泳速度Ucrit
身體適應力（physical fitness）評價
自動化測量、分析
游泳訓練
臨界游泳速度Ucrit、耗氧率（MO2/VO2)
活動代謝率（AMR）
模塊1.成魚呼吸代謝測量
斑馬魚幼魚及成魚呼吸代謝測量系統采用了經典的間歇式(Intermittent flow/stop-flow)測量法，兼具高時間分辨率和長期監測的特點。針對斑馬魚體長短、體重輕、耗氧量低等特點，采用了小型的呼吸室、水泵及非接觸式的光學氧氣傳感器，確保獲得可靠的耗氧曲線和耗氧率數據。系統具備自動控制、測量和分析的功能，放入斑馬魚樣品、設置間歇測量各階段的時間后，系統即可自動運行和計算耗氧率，研究人員也可借助配套軟件計算標準代謝率(SMR)等數據。
易科泰公司提供同時自主集成的斑馬魚呼吸測量系統，可自動切換小型水泵的開閉狀態，實現了自動化間歇式測量。溶解氧監測采用了熒光光纖氧氣傳感器，具備高靈敏度和高分辨率，并且易安裝、零維護。
模塊2. 魚卵、胚胎、幼魚高通量呼吸代謝測量
斑馬魚魚卵、胚胎、幼魚呼吸代謝測量由內置氧氣感應貼片的24孔板、氧氣測量主機、密封配件等組成，多個氧氣測量主機可串聯組成最多240個通道的高通量測量系統。
應用案例
因與哺乳動物具有功能相似的肝臟細胞和與人類相似的脂質代謝，斑馬魚是研究肝病的有效模型。南卡羅萊納醫科大學的研究人員在KDSR（3-酮-二氫鞘氨醇還原酶）突變體斑馬魚中發現了肝病表型過程，并對其發病機制進行了研究。發現KDSR缺失導致鞘脂補救途徑的代償性激活和磷酸鞘氨醇(S1P)的積累，進而導致線粒體活性增加、氧化應激和內質網應激以及隨之而來的肝細胞損傷。因此KDSR可能是一種新的脂肪變性和肝損傷的遺傳風險因子(Park et al., 2019)。
該研究中的耗氧實驗便采用了斑馬魚魚卵、胚胎、幼魚呼吸代謝測量系統，實現了幼魚耗氧率的高通量、快速測定。先在24孔板的每個孔加入125μL的卵水，在24℃下運行20min，之后放入3條幼魚，立即使用封口膜密封和硅膠墊壓實。使用配套軟件記錄，每3min記錄一次溶解氧濃度，持續30min。根據溶解氧濃度隨時間的變化計算了耗氧率，下圖展示了對照組和突變體各3條幼魚的7次測量結果。發現相比于對照組斑馬魚，KDSR突變體的耗氧率有所升高，該結果支持KDSR突變體線粒體β-氧化增強的結論。
模塊3. 高通量視頻跟蹤及行為分析
斑馬魚視頻跟蹤和行為分析系統由高清高幀頻工業相機、斑馬魚行為分析軟件、斑馬魚活動室/池等組成。先錄制高質量斑馬魚活動視頻，再在計算機上使用專業行為分析軟件對視頻中的斑馬魚進行分析，獲得其隨時間變化的行為軌跡（X坐標和Y坐標；單條斑馬魚可做3D跟蹤，包括X、Y、Z坐標），最后自動計算獲得數十種行為學參數。基于機器視覺的斑馬魚行為分析系統，能夠對24孔、48孔、96孔板中的斑馬魚進行高通量行為采集和分析，使研究者輕松獲得大量行為數據。
應用案例
肌側索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS) 是最常見的緩慢進展性運動神經元疾病，以肢體和延髓上、下運動神經元損害并存為特征，臨床表現為進行性四肢骨骼肌無力、肌束震顫，并伴有肌張力增高、腱反射亢進、病理征陽性，最終呼吸衰竭死亡，患者平均生存期為3～5年。
大部分ALS病例為散發型，但仍有約10%的病例為遺傳型，由不同基因突變引起。超氧化物歧化酶1（SOD1）基因突變是主要致病基因，約占遺傳型病例的20%。SOD1在大部分組織中廣泛表達，主要參與自由基清除。盡管SOD1相關的ALS發病機制已有報道，但SOD1突變誘導的病理學機制尚不得而知。為此，高麗大學醫學院的研究人員構建了能夠在成熟少突膠質細胞中表達攜帶G93A突變的人SOD1的轉基因斑馬魚，并考察了其病理特征和對運動神經元的影響(Kim et al., 2019)。
該研究中的行為分析使用了斑馬魚視頻跟蹤和行為分析系統：將成年斑馬魚逐條轉移至1L的水箱中，令其適應30min后，使用攝像機從側面記錄斑馬魚的游泳行為，獲得了平均游泳速度、非活動時間（休息時間）、在水箱底部花費的時間等參數，并對感興趣的行為（包括靜止、異常活動、趨觸性和運動缺陷）的時間進行了統計分析。
發現在8個月之前，SOD1突變斑馬魚和野生型斑馬魚的游泳速度無明顯差異；在早期癥狀階段（8個月-11個月），SOD1突變體斑馬魚的平均游泳速度有所增加；直到疾病晚期SOD1突變斑馬魚游泳速度降低。且在早期癥狀階段，大部分SOD1突變斑馬魚表現出焦慮樣行為失常，包括趨觸性、靜止和異常活動以及輕微的運動缺陷。除此之外，在14個月大的時候，SOD1突變斑馬魚休息的時間占比更大，表明其運動活性降低。
模塊4. 游泳能力
l 斑馬魚游泳能力研究測試系統為一站式方案，包括斑馬魚專用小型游泳室和自動化水流速度控制、校準的所有軟硬件。系統提供適合斑馬魚游泳匹配的高精度控制水流，水流調節速度為0.7 - 50 cm/s。
該系統能夠實現水流速度的校準、轉換、校正和控制，單位和方式任選（如以BL/sec為單位的游泳速度），可對Solid Blocking效應（斑馬魚自身阻礙水流引起的水流速度變化）進行校正，并且能夠創建自動化的用戶自定義程序。
應用案例
心肌病是指心肌在缺血、高血壓等外在壓力和基因突變等內在壓力的作用下發生結構改變，最終導致心力衰竭的心臟疾病。心肌病包括肥厚性心肌病(HCM)、擴張性心肌病(DCM)和限制性心肌病(RCM)等類型。30%~50%的DCM患者有基因突變和家族遺傳背景；80%~90%為常染色體顯性遺傳。高效、高通量的動物模型對于評估相關候選基因、加快新基因發現過程具有重要作用。
美國梅奧醫學醫院的研究人員利用基因組編輯技術得到了已知心肌病基因Gatad1被敲除的斑馬魚(Yang et al., 2016)。在游泳能力測試環節，為增加成年斑馬魚對心力衰竭的易感性，對野生型和突變斑馬魚同時進行高膽固醇飲食和乙醇處理。饑餓24小時后，將斑馬魚放入游泳室。以9 cm/s（200rpm）的速度適應20min后，水流速度以8.66 cm/s (100 rpm) (Ui)的增量遞增，每個速度梯度持續2.5min（Tii）。當斑馬魚力竭，無法從下游恢復游泳時，記錄最大游泳速度（Uii）和測試的總時間（Ti）。之后使其恢復30min，測量體長BL。臨界游泳速度根據以下公式計算：
上述測量結果顯示突變體的游泳能力相比于同齡野生型顯著降低，并且突變斑馬魚在大約7個月大時開始死亡，與同齡野生型對照魚相比，其存活率顯著下降。該結果支持GATAD1是DCM誘發基因的結論。
模塊5. 身體適應力（physical fitness）評價
斑馬魚身體適應力（physical fitness）評價系統將游泳能力研究測試功能和呼吸代謝測量功能相結合，通過測定游泳速度-耗氧率的變化曲線評估斑馬的體力和身體適應性。
應用案例
鋅是人體必需的微量營養成分，在酶活性、免疫功能、神經功能和繁殖等生物過程中起到重要作用。孕婦缺鋅是一個公共衛生問題：據估計高達82%的孕婦鋅攝入量不足。缺鋅既與早產、低出生體重和先天性畸形的增加有關，也與后代葡萄糖耐受性受損、糖尿病易感性增加以及學習和記憶受損有關。
和人類一樣，斑馬魚也需要攝入鋅，并且有類似的調節機制來維持鋅的動態平衡。因此，美國俄勒岡州立大學的研究人員專門為斑馬魚開發了一種缺鋅飼料，用其飼養成年斑馬魚導致其缺鋅。研究結果表明親代缺鋅會使其后代也缺鋅，并對后代產生死亡率顯著增加、體力活動減少等不利影響。缺鋅斑馬魚胚胎中調節金屬內穩態的基因（包括鋅轉運體、金屬調控轉錄因子）表達發生了變化，與糖尿病和胰腺發育相關的基因表達有所下降。缺鋅子代的DNA甲基轉移酶表達下降，意味著親代缺鋅可能導致其子代的表觀遺傳圖譜發生改變。該研究提供了數據支持，證明了缺鋅孕婦補充鋅是有益(Beaver et al., 2017)。
該研究測量了不同水流速度下的成年斑馬魚氧氣消耗率，以評估其身體適應力：以8條成年斑馬魚為一組，放入2.5L的游泳儀，每10min測量一次。采用間歇式的測量方式，具體時間設置為60s等待、240s沖洗、300s測量。先使斑馬魚適應30min，隨后的30min使其在5cm/s（108rpm）的水流速度下自由游動，接著分別將水流速度設置成25 cm/s（504 rpm）和45cm/s（901 rpm），最后恢復至5cm/s（108rpm）的水流速度。每個流速梯度持續30min。取線性相關性高于0.8的數據點進行分析。
如下圖，在適應階段，對照組和缺鋅斑馬魚的耗氧率沒有差異。隨著水流速度的提升，缺鋅斑馬魚游動更劇烈，導致其耗氧率顯著升高。重要的是斑馬魚表現出顯著的飲食效應，即缺鋅斑馬魚比對照組消耗更多的氧氣——在最高水流速度（901rpm）時缺鋅斑馬魚要多消耗28%的氧氣。因此，缺鋅導致斑馬魚身體適應度（physical fitness）降低。
參考論文
1.Beaver, L.M., Nkrumah-Elie, Y.M., Truong, L., Barton, C.L., Knecht, A.L., Gonnerman, G.D., Wong, C.P., Tanguay, R.L., and Ho, E. (2017). Adverse effects of parental zinc deficiency on metal homeostasis and embryonic development in a zebrafish model. The Journal of Nutritional Biochemistry 43, 78–87.
2.Kim, S., Chung, A., Na, J.E., Lee, S.J., Jeong, S.H., Kim, E., Sun, W., Rhyu, I.J., and Park, H. (2019). Myelin degeneration induced by mutant superoxide dismutase 1 accumulation promotes amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 23669.
3.Park, K.-H., Ye, Z., Zhang, J., Hammad, S.M., Townsend, D.M., Rockey, D.C., and Kim, S.-H. (2019). 3-ketodihydrosphingosine reductase mutation induces steatosis and hepatic injury in zebrafish. Sci Rep 9, 1138.
4.Patton, E.E., Zon, L.I., and Langenau, D.M. (2021). Zebrafish disease models in drug discovery: from preclinical modelling to clinical trials. Nat Rev Drug Discov 20, 611–628.
5.Yang, J., Shah, S., Olson, T., and Xu, X. (2016). Modeling GATAD1-Associated Dilated Cardiomyopathy in Adult Zebrafish. JCDD 3, 6.